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細胞爬片的保存和抗原修復問題總結
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1.  細胞爬片可以用含疊氮鈉PBS液保存,但不知道具體濃度,請告知。
答:加在液體中作為防腐劑的疊氮鈉濃度一般為0.04–0.08%。但是我建議對于細胞爬片,還是盡量快的進行處理,以防不必要的問題!
 
2.  我的細胞爬片經過4%多聚甲醛固定,PBS沖洗后直接就放在了-20度,還能用于免疫組化嗎?!
答:應該沒有問題,但是還是現作先染好些,以防抗原的丟失
 
3.  mRNA原位雜交經4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建議用甲醇固定。-20度保存。
 
4.  如果是4%多聚甲醛固定,然后放在PBS中保存,在4度冰箱里保存兩周沒問題。時間再長就沒試過了。
 
5.  丙酮中固定5-10分鐘,然后風干,放置4度保存過夜應該是沒有問題。不要固定過夜,蛋白質固定過度,會影響抗原的暴露,影響免疫組化結果。如果是胞漿 或胞核抗原出現假陰性結果,可考慮應用0.5%的triton-100孵育30分鐘,滲透細胞膜。如果玻片沒有經過特殊處理,不要用其他抗原修復的方法, 會造成掉片,我曾有過這方面的體會。
 
6.  丙酮固定后,PBS洗滌3次,即可保存至4度冰箱備用。
 
7. (1)細胞爬片先用TBS洗3次,每次5分鐘
(2)4%多聚甲醛固定,室溫,20分鐘
(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脫水,通風櫥內干燥,-80度保存。2周沒有問題的,我保存過2個月都有信號,不過還是保存時間短一點的好。
 
8.  我的心肌細胞爬片用不同濃度的乙醇依次脫水后,就放在室溫中,因為是要拍電鏡,但是學校電鏡壞了,呵呵,所以放了一個月后去拍,還是很好。
 
9.  細胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定,用PBS沖洗后,晾干,放在-20度保存一個月沒有問題的。
 
10.  細胞爬片,有機溶劑如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后,輕輕搖動玻片或培養皿等,靜置2 min左右,棄去固定液,不用PBS洗而是采用空氣干燥,干燥后的標本可于-70℃長期保存。解凍時要小心抗原破壞,應先將標本轉移于干冰預冷的固定液, 然后再將混合液轉移至室溫下,固定液到達室溫時取出標本,再用PBS沖洗,在做以后的步驟。
 
11.  我也做過細胞爬片的組化染色,不過沒有遇到類似的問題。細胞培養好后用PBS洗一遍,然后4%多聚甲醛4度固定15分鐘,自然風干。室溫保存幾周內都可 以用的。我想這可能與抗原的類型有關,有的對氧化等損傷比較敏感,有的差一些。最好避光保存在4度,同時盡量隔絕空氣。免疫熒光與普通DAB顯色差別只再 二抗的標記,樣品的保存應該是沒有多大差別的。
 
12.  細胞爬片丙酮固定后-20度保存,現在要再做免疫熒光,將保存的爬片拿出37度復溫然后常規操作就可以了。
 
13.  爬片做免疫組化的優勢在于抗原新鮮,細胞形態保存較好。若爬片需長期保存并出現你這樣的問題,原因可能是:1)試驗步驟有誤,建議重復并加陽性對照片。 2)加一抗前處理同石蠟切片,可進行抗原修復,如胰酶消化或熱修復。3)因為抗原抗體反應在液相中進行,故對已極度干燥的爬片充分水化很重要。建議試驗前 用PBS浸泡過夜。如不能解決你的問題請QQ聯系:81825645。本人在湖南省腫瘤醫院病理科(長沙市)做免疫組化。
 
14.  4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以,也有用無水酒精的,固定好后放-20度,2-3個月是沒有問題的。
 
15. 對于一般的細胞免疫組化,我的做法是:細胞爬片用冰的純丙酮固定20 min,再在通風柜將丙酮吹干,—-20度保存,用丙酮固定作用是沉淀蛋白質和糖,穿透性很強,保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做細胞細胞爬片的固定 劑。當然還是要根據你的實驗目的決定用那種固定劑。
 
如:1.多聚甲醛(常用4%):可用于免疫電鏡;也可用于免疫熒光染色。 主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原,例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。
 
2.乙醇。優點:穿透性強、抗原性保存較好。缺點:但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差,使蛋白變性的作用輕,固定后可再溶解;染色過程中,溫育時間長,抗原可流失而減弱反應強度。
 
3.甲醛(福爾馬林)應用最廣 優點:形態結構保存好,且穿透性強, 缺點: 甲醛放置過久可氧化為甲酸,使溶液pH降低,影響染色; 分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露??稍斐杉僖跣緣娜舊峁?。
 
16. 4度是不能保存這么長時間(1個月)的,如果抗原已被分解,再修復也沒用!
 
17.  棄去固定液,不用PBS洗而是采用空氣干燥,干燥后的標本可于-70℃長期保存。
 
18.  爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒鐘,然后在4%多聚甲醛中固定15分鐘,然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈,注意手法輕柔,要不然掉片很厲害。同時操作過程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功盡棄。
 
將做好的爬片置于濾紙上晾干,然后用中性樹膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續實驗,要不然玻片會掉下來的,就又是前功盡棄了 做好的細胞爬片可以放在-20保存備用,具體能保存多長時間不太清楚,當然盡量早用。
 
19.  固定后放點PBS,然后放在4度冰箱中保存,我最長保存兩個月的,然后再做免疫組化,應該沒有太大的問題的。
 
20.  固定后4度可以存放一周,-20度存放半年,我現在也要做這個,實驗室老師教的。
 
21.  四度放1周應該沒問題的,你最好放在-20度,我在-20度放一個月都還出結果的.很多人作的片子很多,不可能一次作完,一個月沒問題。
 
22.  最佳的固定及保存方法:
(1)中性緩沖福爾馬林(不必調pH):
福爾馬林(40%甲醛,用時加入過量堿式MgCO3中和) 10.0 ml
Na2HPO4.12H2O 1.9653 g
NaH2PO4.2H2O 0.5460 g
加0.85 %NaCl溶液溶解,定容至100 ml。
(2)細胞固定:待細胞接近長成單層時,用鑷子取出蓋玻片,迅速于37℃PBS中漂洗2次,每次3-5秒,以清除血清。
(3)將蓋玻片投入中性緩沖福爾馬林溶液中室溫固定30 min。
(4)用鑷子取出蓋玻片,PBS漂洗2次,每次3-5秒,晾干保存于-20℃備用??沙て詒4?,做實驗時,取出片子,入PBS濕潤后即可進行你的實驗。
可以用于做免疫細胞化學(H.E.)或免疫熒光。
 
23.  細胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱,1個月內可以用。
 
24.  過氧化氫處理這一步,用三蒸水稀釋商品濃度為30%的過氧化氫,然后室溫下玻片放在其中浸泡10 min,是不是過氧化氫導致細胞嚴重脫片?
 
爬片應該用甲醇/雙氧水,你的細胞極可能是過氧化氫導致嚴重脫片。
 
25.  本人比較喜歡用4%得多聚甲醛,20分鐘很好用的。保存的時候注意片子最好晾干,不要擠壓,防止粘片和碎裂。
 
26.  細胞爬片固定好以后,如果要保存,我們的做法是倒掉固定液,PBS漂洗后干片保存在4度,最長半年沒問題。
 
27. (1)用新鮮配制的預冷的4%多聚甲醛緩沖液室溫固定15 min,PBS (0.01 mol/l,pH7.4)洗滌3遍后是否就可以進行免疫細胞化學染色了?
(2)爬片PBS (0.01 mol/l,pH7.4)洗滌3遍后是否能保存,怎樣保存?
答:(1)洗過就可以做免疫組化了。
(2)固定過后自然干燥,不要洗,-20度保存。做之前再洗。
 
28.  細胞固定最好用丙酮或酒精,不要用4%多聚甲醛,以免抗原交聯,這樣組化時不用再抗原修復。細胞固定后可室溫保存在丙酮中,不使之干燥。
 
29.  如果是檢測膜上的物質,好象不能用酒精。
 
30.  適當密度后取出固定(丙酮-20固定10~20 min),再進行免疫染色。
 
31.  一批細胞爬片,如果細胞爬片是在玻璃上,冷丙酮固定15-20分鐘,然后放-20度,沒有問題。如果細胞爬片是在24孔板或6孔板里進行,冷丙酮會腐蝕板子,最好4%多聚甲醛。
 
32.  細胞爬片用純丙酮固定10分鐘,取出干燥后用錫紙包裹,-70度保存。
 
33.  4%多聚甲醛固定后PBS水洗,自然干燥后用錫紙包裹,-20度凍存不超過1月。
 
34.  如果細胞貼壁困難,可將片子先用純血清掛一層,涼干后再養細胞。
 
35.  我們通常是把細胞玻片固定好后,用PBS沖洗干凈,然后用酒精脫水(80%,90%,100%,100%酒精各一次,每次10分鐘左右),然后放在烘箱里烘干,這是就相當于石蠟切片了,可以保存一定的時間。

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